07月19 【成功案例】比較轉(zhuǎn)錄組分析和形態(tài)學(xué)對杏品種（Prunus armeniaca L.）的內(nèi)果皮發(fā)育缺陷的研究
研究背景：
杏（P.armeniaca）屬于薔薇科中常見的一種核果，全世界范圍內(nèi)分布廣泛，具有較高的營養(yǎng)價值，富含膳食纖維、有機酸、維生素C、胡蘿卜素、微量元素等。 木質(zhì)化的內(nèi)果皮（endocarp）在包括杏在內(nèi)的許多具有較高經(jīng)濟價值的核果（drupe fruits）種子發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的作用，為種子提供了安全的發(fā)育環(huán)境，避免了直接暴露于各類害蟲與病原菌。 內(nèi)果皮木質(zhì)化是核果成熟的一個重要標志，木質(zhì)化的過程本質(zhì)上是植物次生細胞壁形成與木質(zhì)素積累的過程，在以往其他核果中的研究發(fā)現(xiàn)，一些與植物生長發(fā)育相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，比如MYB、NAC、MADs-box，在核果內(nèi)果皮的發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色。 本研究以兩種不同內(nèi)果皮表型的兩種杏作為實驗材料，借助高通量測序來揭示杏內(nèi)果皮發(fā)育背后的分子調(diào)控機制。
材料與方法：
測序材料：
LE品種杏 內(nèi)果皮薄、柔軟、韌性高 JG品種杏 內(nèi)果皮厚、堅硬、韌性低 取樣部位： 去核果實 測序平臺： Illumina HiSeq? 2500 PE125測序
技術(shù)路線：
結(jié)果–LE、JG品種杏內(nèi)果皮表型觀察比較
a）如圖2所示，兩種品種杏的果實具有相似的發(fā)育模式，a1、b1、c1是以開花后時間（DAFB)為橫坐標，分別以果實重量、果實長度、果實寬度為縱坐標做圖，兩種杏的果實均呈現(xiàn)出了“雙S曲線”生長模式，圖a2、b2、c2是分別對a1、b1、c1一階導(dǎo)數(shù)作圖，兩種果實同樣也表現(xiàn)出相似的趨勢。 根據(jù)生長曲線，研究者將果實的發(fā)育劃分為4個時期：第一次指數(shù)生長期（before 30DAFB）、緩慢生長期（30-49DAFB）、第二次指數(shù)生長期（49-83DAFB）、成熟期（after 83DAFB）。
b）圖3展示了兩種品種杏的內(nèi)果皮在果實發(fā)育的不同階段各項指標的比較，包括內(nèi)果皮木質(zhì)素含量（圖3d）、內(nèi)果皮厚度（圖3e）、內(nèi)果皮界面面積（圖3c）、內(nèi)果皮木質(zhì)素積累直觀觀察（圖3b）、內(nèi)果皮顯微鏡直觀觀察結(jié)果（圖3a）。 圖3a顯示，LE品種與JG品種的內(nèi)果皮在15DAFB之前形態(tài)上基本無差異，15DAFB之后，LE品種的內(nèi)果皮開始出現(xiàn)破裂缺失，隨著發(fā)育階段往后推移，破裂程度越來越大。 圖3e顯示，LE品種與JG品種的內(nèi)果皮在30DAFB之前厚度上并無差異，之后在厚度上，兩種品種出現(xiàn)顯著差異。 圖3d顯示，LE品種與JG品種的內(nèi)果皮中木質(zhì)素含量也在24DAFB之后出現(xiàn)顯著差異。
綜合以上表型觀察結(jié)果得出，LE品種與JG品種的內(nèi)果皮發(fā)育過程以及內(nèi)果皮木質(zhì)素含量存在顯著差異。
結(jié)果–mRNA測序與轉(zhuǎn)錄本組裝
a）測序取樣部位 ： 去核后的果實，每個品種兩個生物學(xué)重復(fù) 測序取樣時間點 ： 根據(jù)上一部分的表型觀察結(jié)果，LE品種內(nèi)果核在15DAFB時出現(xiàn)裂縫，在24DAFB時，裂縫程度開始快速增大，因此，該mRNA測序項目選擇了15DAFB和24DAFB兩個時間點樣本 b）轉(zhuǎn)錄本組裝：測序共得到~20Gbase clean data，使用Trinity軟件組裝得到63,170條unigene，unigene N50大小1689bp，詳細組裝結(jié)果參見表1。
結(jié)果–unigene功能注釋
a）基于blast比對，63,170條unigene中有25,356可比對到日本杏（Japanese apricot）與桃（peach）基因組數(shù)據(jù)庫。 b）使用BLASTx（e-value閾值設(shè)為10e-5）將上述25,356條unigene比對到NR, Swiss-Port, GO, COG, KOG ，kegg數(shù)據(jù)庫以進行功能注釋，每條unigene均有多條注釋，詳細的注釋結(jié)果統(tǒng)計信息請參見表3. c）GO數(shù)據(jù)庫注釋過程中，16,506條unigene被注釋到，其中， ‘metabolic process’ (8408 genes, 50.93%)是被注釋到最多的GO 條目；KEGG數(shù)據(jù)庫注釋過程中，4830條unigene被注釋到了118個代謝通路。大部分的unigene被注釋到了‘carbohydrate metabolism’ (905 genes), ‘translation’ (596 genes), ‘a(chǎn)mino acid metabolism’ (581 genes), or ‘folding, sorting and degradation’ (471 genes)等代謝通路。
結(jié)果–差異表達基因檢測
使用DESeq進行了差異表達基因檢測，差異表達基因篩選閾值為：FDR<0.01，F(xiàn)C > 2 。15DAFB時間點上，兩個品種間檢測到差異表達基因2887個，24DAFB時間點上，兩個品種間檢測到差異表達基因886個，具體上下調(diào)、共有特有情況請參見圖5.
結(jié)果–差異表達基因功能分析
a）LE品種內(nèi)果皮破裂與發(fā)育不全是一個非常復(fù)雜的表型，與眾多的代謝通路相關(guān)，但類苯基丙烷相關(guān)通路是眾多代謝通路中已經(jīng)證實的非常重要的一個。該項目中對兩個品種在兩個時間點的差異表達基因的KEGG富集分析結(jié)果也證實了上述事實，所以差異基因顯著富集于類苯基丙烷代謝、合成等通路。類苯基丙烷相關(guān)通路相關(guān)差異表達基因見列表4與圖6。
b）一些轉(zhuǎn)錄因子也被報道與內(nèi)果皮發(fā)育相關(guān)，包括SHP 、 STK、ALC、IND、FUL、RPL、NST1、NST3以及一些MYB家族轉(zhuǎn)錄因子。該項目中，SHP, FUL, MYB32 ,STK, MYB46–1, MYB46–2, ?NST1 也包含在兩個品種間的差異表達基因列表中，也發(fā)現(xiàn)了上述部分基因差異表達方向與預(yù)期不符。
結(jié)果–RT-PCR驗證
挑取18個表型相關(guān)基因，對測序分析得到的差異表達結(jié)果進行了驗證，結(jié)果顯示，兩種技術(shù)得到的基因定量結(jié)果間的pearson相關(guān)系數(shù)可達到0.9188, P value 小于 0.0001，說明測序分析結(jié)果具有較高的可靠性，RT-PCR定量結(jié)果參見圖8。
結(jié)果–共表達分析
a）文章最后，使用K-means聚類對之前得到的差異表達基因進行了共表達分析，分析結(jié)果顯示：基于表達趨勢，所有差異基因可劃分為7個cluster，每個cluster內(nèi)部的基因具有相似的表達趨勢，也就可能在細胞內(nèi)行駛著相似的功能，聚類結(jié)果見圖7。 b）之前分析得到的內(nèi)果皮發(fā)育相關(guān)基因大多分布在cluster1或者cluster6，cluster1中的基因在LE品種中高表達，JG品種低表達，cluster6與cluster1相反。
結(jié)論：
1）LE品種杏的內(nèi)果皮裂縫出現(xiàn)于15 DAFB（開花后15天），裂縫面積也會在之后會越來越大；
2）成熟的LE品種杏的內(nèi)果皮的厚度及木質(zhì)素含量分別僅為內(nèi)果皮正常發(fā)育品種JG的60.39%、63.25%；
3）已有研究表明與內(nèi)果皮發(fā)育相關(guān)的一些轉(zhuǎn)錄因子及類苯基丙烷合成代謝相關(guān)基因，也包含于該項目得到的差異表達基因列表中；
4）一些轉(zhuǎn)錄因子尤其是NST1可能參與調(diào)控了類苯基丙烷相關(guān)代謝通路；