09月01 【成功案例】小RNA和降解組聯(lián)合測序揭示microRNA調節(jié)茶葉(Camellia sinensis)中兒茶素生物合成

小RNA和降解組聯(lián)合測序揭示microRNA調節(jié)茶葉(Camellia sinensis)中兒茶素生物合成

Combined small RNA and degradome?sequencing reveals complex microRNA?regulation of catechin biosynthesis in tea?(Camellia sinensis)

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雜志：PLOS ONE

影響因子：2.806

PMID:?28225779

 

研究背景

MicroRNAs是一種內源性非編碼小RNA，在動植物轉錄后調控及其他生物學過程中有至關重要的作用?；趬A基互補配對機制，miRNAs主要通過直接切割目標mRNA和抑制目標基因轉錄這兩種方式調節(jié)目標基因的表達。前期研究表明，miRNA參與多種植物的生長和發(fā)育過程，如：根、葉、花的形態(tài)發(fā)生，信號轉導，激素反應和營養(yǎng)代謝等。植物miRNAs主要通過克隆、生物信息預測、高通量測序和Northern 雜交的方法來檢測。最常用的技術是高通量測序，不僅經濟實惠，而且在低豐度的情況下可以更簡單、快速獲得大量miRNAs。植物中miRNA主要是通過切割目標基因或者抑制目標基因的表達進行調控，所以目標基因的確定對miRNA功能的分析至關重要。miRNAs目標基因的預測可以通過生物信息的方法，目標基因的鑒定主要通過降解組測序和5’-RLM-RACE方法（RNA連接酶介導的5’cDNA末端的快速擴增），這兩種方式還能鑒定miRNA目標基因切割位點，有助于miRNA功能分析。

茶樹（Camellia sinensis），富含兒茶素，是風靡全球的非酒精飲料之一。兒茶素是茶葉中重要的組成部分，包括脂型兒茶素（如：ECG和EGCG）和非脂型兒茶素（如：EC和EGC）。EGCG是茶葉中含量最豐富的兒茶素并且具有較強的抗癌效果，可以制約癌細胞的生長，抑制雄激素受體的功能并調控癌細胞的生存，血管的生成和移動。基于他們的分子構成，兒茶素可以分為簡單兒茶素和脂型兒茶素。在兒茶素的合成過程中有許多酶的參與，如查耳酮合酶（CHS），查爾酮異構酶（CHI），黃烷酮醇4-還原酶（DFR），花青素合酶（ANS），花青素還原酶（ANR）和類黃酮3,5羥基化酶（F3’5’H）。MiRNA被鑒定為轉錄和轉錄后水平基因表達的重要調節(jié)因子，并且裂解目標mRNA是植物中基因表達的主要調控方式。

在茶樹中，雖然通過高通量測序和芯片技術發(fā)現(xiàn)了許多保守的以及新的miRNAs，但是miRNAs直接調控兒茶素生物合成還沒有明確的定義。此項研究中，研究人員通過高通量測序鑒定茶葉中保守的以及新的miRNAs，再通過5’-RLM-RACE方法分析潛在的目標miRNAs。通過表達模式分析進一步篩選兒茶素積累過程中潛在的miRNAs。結合5’-RLM-RACE實驗和表達模式分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些新的調節(jié)兒茶素生物合成途徑中基因切割的調控因子。

材料和方法

實驗材料

茶樹1005，取葉片（包括芽，第一葉，第二葉，第三葉，第四葉，第五葉，成熟葉），進行混合，提取總RNA。

茶樹1005，取葉片（包括第一葉，第三葉，成熟葉），進行qRT-PCR表達分析和兒茶素含量測定。

測序平臺：Illumina?HiSeq 2500?（Biomarker Technology Co.）

技術路線

實驗結果

1.茶葉中miRNA的初步分析

從提取的總RNA中構建smallRNA文庫，測序質控后得到19，567，691條clean reads，與數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)有18.83%的rRNA，1.23%的tRNA，0.01%的small nuclear RNA，0.07%的重復序列，其中79.85%的序列沒有功能注釋，可以將這些沒有功能注釋的序列用來做下一步的miRNA的預測和鑒定。根據(jù)smallRNA的測序長度分布圖可以得出，miRNA的長的主要分布在20-25nt之間，豐度最高的是24nt（47.89%）。這個長度分布和其他栽培茶以及其他植物報道的結果非常相似。

2.茶葉中保守miRNAs的鑒定

將沒有功能注釋的clean reads與miRBase（植物已知保守miRNA數(shù)據(jù)庫）進行比對，共獲得69個保守的miRNAs，分別屬于62個家族。根據(jù)長度分布發(fā)現(xiàn)，這些保守的miRNAs的長度主要集中在18-25nt之間，長度主要集中在24nt（46.385），其次是21nt。

對高通量測序的miRNA片段進行分析，鑒定的保守miRNA中，read values低于1000的占91.3%的比例，其中read values低于10的占56.52%的比例。研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些高表達(read values大于1000)的miRNA家族，如miR165a和miR396a。另外，在不同家族中的miRNAs表達量差異較大，并且在同一家族中各miRNAs之間的表達量也有較大差異。這些數(shù)據(jù)表明，不同家族miRNA的表達模式不同，意味著不同的miRNAs在茶樹生長發(fā)育過程中的作用不一樣。

3.茶葉中新miRNAs的鑒定

通過miRDeep2和Mfold軟件分析，共鑒定出47個新的miRNAs，進一步對這些新miRNA進行片段長度和表達量分析。新miRNA跟保守miRNA長度分布相似，主要集中在18-25nt之間，最集中的長度是24nt和21nt。另外，新miRNA的表達量比保守miRNA的低，新miRNA中表達量最高的只有4517個read values。

 

研究人員將這些新的miRNA與其他植物中已知的miRNA進行比對，揭示了許多同系物。除了三個miRNA歸為同一個家族外，絕大多數(shù)的miRNA可以被分為獨立的家族。研究者還對新miRNA的前體進行了分析，發(fā)現(xiàn)他們都有一個發(fā)卡環(huán)結構，長度在84-114bp。

4.GO功能富集和KEGG通路分析目標miRNA

為了研究茶樹miRNA的功能，研究人員運用TargetFinder軟件和轉錄序列對上述miRNA進行目標基因預測。結果顯示，其中97個miRNA對644個目標基因有調控作用。再將644個目標基因進行GO和KEGG通路富集分析：GO富集分析發(fā)現(xiàn)這些目標基因主要富集在細胞、細胞器、細胞膜、連接活性、轉運活性、新陳代謝和細胞進程等功能條目；KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)366個目標基因參與36個代謝網(wǎng)絡相關，主要參與糖酵解、檸檬酸循環(huán)、氨基酸代謝、光合作用、脂肪酸代謝、嘌呤嘧啶代謝、氧化磷酸化、植物病原體相互作用、初級代謝產物和次級代謝產物過程。

5. miRNA靶向基因降解組測序和功能分析

為了進一步預測和鑒定miRNA靶向基因，研究團隊構建了降解組文庫并進行深度測序，結合轉錄組數(shù)據(jù)和上述獲得的miRNAs，通過TargetFinder軟件預測到216個靶向基因被97個miRNAs調控。在這些靶向基因中，降解組測序鑒定了26個基因的26個切割位點，被16個miRNA家族的19個miRNAs進行轉錄后調控，如表1。

表1.通過降解組測序鑒定茶樹1005中miRNA靶向基因

6. 基于5’-RLM-RACE技術對目標斷裂位點的驗證

研究人員采用5’-RLM-RACE的方法，對其中5個有注釋的miRNA（來自降解組測序）切割位點進行驗證。結果顯示，目標基因comp152929被csn-miR396a1 和?csn-miR396a2共同調控，切割位點在目標基因的第11-12個核苷酸處；兩個基因comp159882和comp157894同時被miRNA167a調控，且有共同的切割位點，在目標基因的第11-12個核苷酸處；另外，miRNA394a調控comp156493，切割位點有兩處，分別為第10-11，17-18個核苷酸處；同樣的，novel-miR2調控comp145093，切割位點也有兩處，分別為第10-11，12-13個核苷酸處。5’-RLM-RACE的實驗驗證了這些降解組分析的結果，另外一些切割位點有待進一步的驗證。

7.茶葉中miRNA的表達模式分析

對茶樹1005葉片兒茶素含量的研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素在不同葉片中的的含量由高到低排序為：第一葉，芽，第二葉，第三葉，成熟葉。第一葉，第三葉和成熟葉的兒茶素含量有顯著差異。

為了探索茶葉中miRNAs與兒茶素合成相關性，研究人員采用qRT-PCR的方法分析第一葉、第三葉以及成熟葉中miRNA（read values高于平均值）表達。通過表達模式的成簇分析將這些miRNA分成三組。第一組，miRNA表達模式與兒茶素含量成正相關，分別有novel-miR10, novel-miR13, novel-miR19, csn-miR165a, csn-miR170, csn-miR2593e 和novel-miR12；第二組，miRNA表達模式與兒茶素含量成負相關，分別有novel-miR1, novel-miR2, csn-miR160a, csn-miR162a, csn-miR394 和csn-miR396a；第三組，miRNA表達模式與兒茶素含量沒有顯著相關性，有csn-miR4380a。

8.調控兒茶素生物合成基因miRNA的鑒定

為了深入了解miRNA在調控兒茶素合成代謝中的功能，研究人員將高通量測序獲得的miRNA跟NCBI數(shù)據(jù)庫以及RNA測序的兒茶素生物合成相關基因的mRNA進行BLAST，預測可能的miRNA。為了消除假陽性，對預測的斷裂位點進行實驗驗證。通過5’-RLM-RACE實驗驗證了6個可能參與兒茶素生物合成功能基因表達調控的miRNA。它們分別是csn-miRNA167a、f csn-miR2593e、csn-miR4380a 、csn-miR3444b 、csn-miR5251 和csn-miR7777-5p.1。

9.兒茶素生物合成路徑基因和miRNAs表達分析

為了更好的了解兒茶素生物合成過程中miRNA與目標基因之間的表達模式以及相互作用，研究人員將不同葉片中兒茶素生物合成相關基因和miRNA表達量進行分析，并且與兒茶素含量變化的模式相比較。結果顯示，ANR和C4H有相似的表達模式，ANR在第三葉中表達量最高，它與EC，EGC和兒茶素含量沒有明顯的關系，在綠茶Shuchazao中有過類似的報道。CHI和DFR的表達量與兒茶素的含量成正相關的趨勢，這與之前的報道一致。經分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的miRNA表達模式與目標基因呈相反的趨勢?？傊?，miRNA和目標mRNA之間的表達模式和斷裂位點的負相關性是兒茶素生物合成中目標miRNA靶向調控mRNA的有力證據(jù)。

結論

該研究共鑒定了69個保守的miRNAs和47個新的miRNA。再結合降解組測序的和生物信息分析的方法預測了受19個miRNA調控的16個基因切割位點。通過5’-RLM-RACE實驗對其中5個有注釋的miRNA切割位點進行了驗證。qRT-PCR結果顯示：novel-miR1, novel-miR2,csn-miR160a, csn-miR162a, csn-miR394 和 csn-miR396a與兒茶素含量負相關。6個miRNA（csn-miRNA167a，csn-miR2593e，csn-miR4380a，csn-miR3444b，csn-miR5251和csn-miR7777-5p.1）及其與兒茶素生物合成相關的靶基因的表達也通過qRT-PCR進行了分析；這些miRNA和兒茶素含量之間呈正相關和負相關，而在其目標基因和兒茶素含量之間呈正相關。這個結果表明這些miRNA可能通過下調它們來負調節(jié)兒茶素生物合成生物合成相關靶基因。綜上所述，miRNA是茶葉中關鍵的調節(jié)因子，5′-RLM-RACE和表達分析的結果揭示了miRNAs在兒茶素合成代謝中的重要作用。

創(chuàng)新點

本研究采用多種生物技術手段的聯(lián)合分析（高通量測序，降解組測序，qRT-PCR技術和5’-RLM-RACE技術），尋找到新的調節(jié)兒茶素生物合成的miRNA，并且驗證了miRNA調控的切割位點。